Επεξεργάστηκε από τον Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, California, εγκρίθηκε στις 25 Δεκεμβρίου 2020 (αναθεωρήθηκε στις 25 Οκτωβρίου 2020)
Αναφέρουμε την αλληλεπίδραση μεταξύ υπομονάδων στην αντιγραφή συμπλεγμάτων κορωνοϊών-μεταγραφής, τα οποία είναι απαραίτητα για την αντιγραφή και την εξελικτική διατήρηση.Παρέχαμε στοιχεία ότι ο τομέας NiRAN που σχετίζεται με το nsp12 έχει δραστηριότητα μονοφωσφορικής νουκλεοσιδικής (NMP) τρανσφεράσης σε trans και προσδιορίσαμε το nsp9 (πρωτεΐνη που δεσμεύει RNA) ως στόχο του.Το NiRAN καταλύει την ομοιοπολική σύνδεση του τμήματος NMP στο διατηρημένο αμινο άκρο nsp9 σε μια αντίδραση που βασίζεται σε ιόντα Mn2+ και παρακείμενα διατηρημένα υπολείμματα Asn.Διαπιστώθηκε ότι η δραστηριότητα NiRAN και η nsp9 NMPylation είναι απαραίτητες για την αναπαραγωγή του κορωνοϊού.Τα δεδομένα μας επιτρέπουν να συνδέσουμε αυτή τη δραστηριότητα του δείκτη ενζύμου ένθετου ιού με τις προηγούμενες παρατηρήσεις στην υπόθεση ότι η έναρξη της σύνθεσης RNA σε μια κατηγορία ιών RNA είναι λειτουργικά και εξελικτικά συνεπής.
Η εξαρτώμενη από RNA πολυμεράση RNA (RdRps) των Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae και 12 άλλες οικογένειες) συνδέεται με την αμινοτελική (Ν-τερματική) περιοχή στη μη δομική πρωτεΐνη (nsp) που απελευθερώνεται από την πολυπρωτεΐνη, που ονομάζεται NiRAN Το 1ab αποτελείται από ιική κύρια πρωτεάση (Mpro).Προηγουμένως, αναφέρθηκε η δραστηριότητα GMPylation/UMPylation του αρτηριακού ιού NiRAN-RdRp nsp και προτάθηκε η δημιουργία ενός παροδικού για τη μεταφορά μονοφωσφορικού νουκλεοσιδίου (NMP) στον (άγνωστο προς το παρόν) ιό και/ή κυτταρικό βιοπολυμερισμό Things.Εδώ, δείχνουμε ότι ο κορωνοϊός (Human Coronavirus [HCoV]-229E και Σοβαρό Οξύ Αναπνευστικό Σύνδρομο Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) έχει δραστηριότητα NMPylation που εξαρτάται από Mn2+, η οποία προέρχεται από το nsp9 μέσω του σχηματισμού Mpro-μεσολαβούμενης nsp9 Μετά το Ν-τερματικό πλευρικό nsps απελευθερώνεται πρωτεολυτικά, το φωσφοραμιδικό συνδέεται με την πρωτοταγή αμίνη (Ν3825) στο Ν-τελικό άκρο του nsp9.Η τριφωσφορική ουριδίνη είναι το προτιμώμενο νουκλεοτίδιο σε αυτή την αντίδραση, αλλά η τριφωσφορική αδενοσίνη, η τριφωσφορική γουανοσίνη και η τριφωσφορική κυτιδίνη είναι επίσης κατάλληλα συν-υποστρώματα.Μελέτες μετάλλαξης που χρησιμοποιούν ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες κορωνοϊού nsp9 και nsp12 και μεταλλαγμένα με γενετική μηχανική HCoV-229E προσδιόρισαν τα υπολείμματα που είναι απαραίτητα για τη μεσολάβηση του NiRAN nsp9 NMPylation και τον αναδιπλασιασμό του ιού σε κυτταρική καλλιέργεια.Τα δεδομένα επιβεβαίωσαν την πρόβλεψη των υπολειμμάτων ενεργού θέσης NiRAN και προσδιόρισαν τον σημαντικό ρόλο των υπολειμμάτων nsp9 N3826 στην nsp9 ΝΜΡυλίωση και την αντιγραφή του ιού in vitro.Αυτό το υπόλειμμα είναι μέρος της διατηρημένης Ν-τερματικής τριπεπτιδικής αλληλουχίας NNE και αποδείχθηκε ότι είναι το μόνο αμετάβλητο υπόλειμμα του nsp9 και των ομολόγων του στην οικογένεια των κοροναϊών.Αυτή η μελέτη παρέχει μια σταθερή βάση για τη λειτουργική μελέτη της δραστηριότητας ΝΜΡυλίωσης άλλων ένθετων ιών και προτείνει πιθανούς στόχους για την ανάπτυξη αντιιικών φαρμάκων.
Ο θετικός-κλώνος ιός RNA Nidovirales μολύνει μια ποικιλία σπονδυλωτών και ασπόνδυλων (1, 2).Η παραγγελία περιλαμβάνει επί του παρόντος 14 οικογένειες (3), εκ των οποίων η οικογένεια του Coronavirus έχει μελετηθεί εκτενώς τα τελευταία 20 χρόνια.Εκείνη την εποχή, τρεις ζωονοσογόνοι κοροναϊοί εμφανίστηκαν από ξενιστές ζώων και προκάλεσαν μεγάλης κλίμακας εστίες σοβαρών αναπνευστικών λοιμώξεων στον άνθρωπο.Συμπεριλαμβανομένων των επίμονων πανδημιών που προκαλούνται από σοβαρές οξείες μολυσματικές ασθένειες.Αναπνευστικό Σύνδρομο Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Οι νιδοϊοί μοιράζονται μια κοινή οργάνωση γονιδιώματος και η υπομονάδα του συμπλέγματος αντιγραφής-μεταγραφής που συνδέεται με τη μεμβράνη (RTC) κωδικοποιείται στα 5-β²-τερματικά δύο τρίτα και στην κύρια δομική υπομονάδα του σωματιδίου του ιού, καθώς και σε ορισμένα εξαρτήματα .Πρωτεΐνη, που κωδικοποιείται στο 3?2 άκρο τρίτο του γονιδιώματος (1).Με εξαίρεση μια οικογένεια επιπεδικών ιών (Monoviridae) (8), όλοι οι ένθετοι ιοί κωδικοποιούν υπομονάδες RTC σε δύο μεγάλα ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ORF) ORF1a και ORF1b, τα οποία μεταφράζονται από το γονιδιωματικό RNA του.Το ORF1a κωδικοποιεί την πολυπρωτεΐνη (pp) 1a και τα ORF1a και ORF1b κωδικοποιούν από κοινού pp1ab.Με τη γενική συμμετοχή της κύριας πρωτεάσης (Mpro) που κωδικοποιείται από το ORF1a, τόσο η pp1a όσο και η pp1ab υποβάλλονται σε πρωτεολυτική επεξεργασία σε μια ποικιλία μη δομικών πρωτεϊνών (nsps), επίσης γνωστές ως 3CLpro, επειδή έχει ομολογία με το 3Cpro του ιού picorna ( 9).Αυτά τα nsps πιστεύεται ότι συναρμολογούνται σε ένα μεγάλο δυναμικό RTC, καταλύουν τη σύνθεση του γονιδιωματικού RNA (αντιγραφή) και ενός συνόλου υπογονιδιωματικού RNA (μεταγραφή) και χρησιμοποιούνται για τον συντονισμό της έκφρασης του ORF που βρίσκεται κατάντη του ORF1b (10?? ?12).
Ο πυρήνας RTC περιλαμβάνει RNA πολυμεράση RNA (RdRp) (13), ελικάση υπεροικογένειας 1 (HEL1) (14, 15) και αρκετά ένζυμα επεξεργασίας RNA, τα οποία κωδικοποιούνται κυρίως στο ORF1b και στην οικογένεια των κοροναϊών. Περιέχει nsp12-nsp16 και nsp9-nsp12 στην οικογένεια Arterioviridae (βλέπε αναφορά 10ââ 12).Τα RdRp και HEL1 αντιπροσωπεύουν δύο (το ένα πέμπτο) συντηρημένες περιοχές του ιού της φωλιάς των πτηνών και έχουν ομολογία μεταξύ άλλων ιών RNA.Η πυρηνική ρεπλικάση πιστεύεται ότι υποβοηθάται από άλλες υπομονάδες, συμπεριλαμβανομένων πολλών μικρών nsps που απελευθερώνονται από την καρβοξυτελική (C-τερματική) περιοχή του pp1a, κατάντη του Mpro (κορωνοϊός nsp5 και αρτηριακός ιός nsp4, αντίστοιχα).Έχουν περιορισμένη προστασία για την οικογένεια και ποικίλες δραστηριότητες (ανασκόπηση στην αναφορά 10ââ12).
Σχετικά πρόσφατα, ένας τομέας με μοναδικά χαρακτηριστικά μοτίβου αλληλουχίας βρέθηκε στο αμινοτελικό άκρο (Ν-άκρο) δίπλα στον RdRp σε όλους τους ένθετους ιούς, αλλά όχι σε άλλους ιούς RNA (16).Με βάση τη θέση του και τη δραστηριότητα της νουκλεοτιδικής τρανσφεράσης (νουκλεοσιδική μονοφωσφορική τρανσφεράση [NMP] τρανσφεράση), αυτός ο τομέας ονομάζεται NiRAN (Nestvirus RdRp-related Nucleotide Transferase).Ο συνδυασμός διπλού τομέα του NiRAN-RdRp αποτελεί το nsp12 στην οικογένεια Coronaviridae και το nsp9 στην οικογένεια των Arterioviridae, και σε άλλα nestoviridae, το NiRAN-RdRp αναμένεται να απελευθερωθεί ως ανεξάρτητο nsp από την ιική πολυπρωτεΐνη.Στον κορωνοϊό, η περιοχή NiRAN περιέχει υπολείμματα α1/450 και συνδέεται με την C-τερματική περιοχή RdRp μέσω της περιοχής συνδέτη (16-19).Στον ιό της αρτηρίτιδας των ιπποειδών (EAV) (Arteriviridae), το ανασυνδυασμένο nsp9 δείχνει δραστηριότητες UMPylation και GMPylation που εξαρτώνται από Mn2+ ιόντα, οι οποίες εξαρτώνται από τρεις διατηρημένες βάσεις αλληλουχίας στον νεστοϊό, AN, BN και CN Τα υπολείμματα στην αλληλουχία.Όπου το N σημαίνει NiRAN) (16).Η Ν-τελική πλευρική όψη αυτών των μοτίβων είναι ένα λιγότερο συντηρητικό μοτίβο preAN.Μερικά από αυτά τα υπολείμματα διατηρούνται επίσης σε απομακρυσμένα συγγενείς πρωτεϊνικές κινάσες, όπου έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκονται στη σύνδεση τριφωσφορικού νουκλεοσιδίου (NTP) και στην καταλυτική δραστηριότητα (20, 21).Σύμφωνα με αυτήν την παρατήρηση, πολλά υπολείμματα βασικής ενεργής θέσης στην ψευδοκινάση SelO από Pseudomonas syringae μπορούν να συναρμολογηθούν με το πρόσφατα δημοσιευμένο υπερσύμπλεγμα SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13.Διατηρημένα υπολείμματα του κορωνοϊού NiRAN που υπερτίθενται στην ηλεκτρονική μικροδομή.Ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη (17).Εικάζεται ότι η τεκμηριωμένη (αυτο) U/GMPylation θα παράγει μια μεταβατική κατάσταση για τη μεταφορά NMP στο (άγνωστο προς το παρόν) υπόστρωμα (16) και η δομική ομοιότητα μεταξύ NiRAN και πρωτεϊνικής κινάσης (17, 19) είναι η υπόθεση ότι Το NiRAN τροποποιεί άλλες πρωτεΐνες.
Πολλά χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένης της μοναδικής και μοναδικής συστηματικής συσχέτισης του με ένθετους ιούς και του γενετικού διαχωρισμού από το RdRp, καθιστούν το NiRAN ένα λογικό βασικό ρυθμιστικό ένζυμο για ένθετους ιούς, το οποίο είναι κρίσιμο για την εμφάνιση και την ταυτότητά τους.Προηγουμένως, κλήθηκαν τρεις πιθανές λειτουργίες που περιελάμβαναν το NiRAN για τη ρύθμιση της μετάφρασης ή της αντιγραφής/μεταγραφής του γονιδιώματος/υπογονιδιώματος.Όταν εξετάζουμε τα σπάνια και ελλιπή δεδομένα που είναι διαθέσιμα εκείνη τη στιγμή, κάθε συνάρτηση έχει τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματά της (16).Σε αυτήν την έρευνα, στοχεύουμε να συνδυάσουμε τις βιοχημικές και αντίστροφες γενετικές μελέτες των κοροναϊών που αντιπροσωπεύουν τα δύο γένη και να βάλουμε τα ευρήματά μας στο εξελικτικό υπόβαθρο της φυσικής μετάλλαξης της οικογένειας των κοροναϊών, ώστε να αποκτήσουμε εικόνα για αυτό το Μυστήριο βασίλειο.Αναφέρουμε σημαντικές προόδους στην κατανόηση του NiRAN μέσω της αναγνώρισης φυσικών στόχων στο RTC, το οποίο (μεταξύ των τριών διαθέσιμων υποθέσεων) συμβάλλει στον ρόλο αυτού του τομέα στην έναρξη της σύνθεσης του ένθετου RNA του ιού.Αυτή η έρευνα ανοίγει επίσης δυνατότητες για άλλους ρόλους του NiRAN στη διεπαφή ξενιστή του ιού.
Προκειμένου να χαρακτηριστούν οι ενζυματικές ιδιότητες του τομέα NiRAN που σχετίζεται με τον κορονοϊό nsp12, δημιουργήσαμε μια ανασυνδυασμένη μορφή ανθρώπινου κορωνοϊού 229E (HCoV-229E) nsp12 σε E. coli, με ετικέτα His6 στο C-άκρο και συνδυάσαμε την πρωτεΐνη με [α32-Ρ] Επωάστε μαζί με ΝΤΡ παρουσία MnCl2 όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι.Η ανάλυση του προϊόντος της αντίδρασης έδειξε την παρουσία μιας ραδιοσημασμένης πρωτεΐνης που συν-μεταναστεύει με nsp12 (106 kDa), υποδεικνύοντας ότι ο κορωνοϊός nsp12 καταλύει τον σχηματισμό ομοιοπολικών προϊόντων προσθήκης πρωτεΐνης-NMP, που σχηματίζονται κατά προτίμηση με μονοφωσφορική ουριδίνη (UMP) (Εικόνα 1Α) Και ΣΙ).Η ποσοτική ανάλυση έδειξε ότι σε σύγκριση με άλλα νουκλεοτίδια, η ένταση του σήματος της ενσωμάτωσης UMP αυξήθηκε κατά 2 έως 3 φορές (Εικόνα 1C).Αυτά τα δεδομένα είναι σύμφωνα με την προβλεπόμενη δραστηριότητα τρανσφεράσης NMP του τομέα NiRAN του κοροναϊού (16), αλλά υποδεικνύουν ότι οι προτιμήσεις νουκλεοτιδίων του τομέα NiRAN του κορωνοϊού και του αρτηριακού ιού είναι διαφορετικές.
Δραστηριότητα αυτο-ΝΜΡυλίωσης του HCoV-229E nsp12.(Α) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) επωάστηκε με το χαρακτηρισμένο [α-32P] NTP παρουσία 6 mM MnCl2 για 30 λεπτά (βλ. Υλικά και Μέθοδοι για λεπτομέρειες).Τα προϊόντα αντίδρασης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και χρωματίστηκαν με Coomassie brilliant blue.(Β) Η ραδιοσημασμένη πρωτεΐνη οπτικοποιείται με απεικόνιση φωσφόρου.Οι θέσεις των δεικτών μοριακής μάζας nsp12-His6 και πρωτεΐνης (σε kilodaltons) φαίνονται στα Α και Β. (C) Η ένταση του ραδιενεργού σήματος (μέσος όρος ± SEM) προσδιορίστηκε από τρία ανεξάρτητα πειράματα.*P≤0,05.Η ισχύς του σήματος (ποσοστό) σχετίζεται με το UTP.
Αν και οι ενζυμικές δραστηριότητες που σχετίζονται με το NiRAN έχουν αποδειχθεί ότι είναι απαραίτητες για την αντιγραφή του EAV και του SARS-CoV σε κυτταρική καλλιέργεια (16), η συγκεκριμένη λειτουργία NiRAN και οι πιθανοί στόχοι δεν έχουν ακόμη προσδιοριστεί.Η πρόσφατα αναφερθείσα δομική ομοιότητα μεταξύ του NiRAN και μιας οικογένειας πρωτεϊνών με πτυχές που μοιάζουν με πρωτεϊνική κινάση (17, 22) μας ώθησε να ελέγξουμε την υπόθεση ότι το NiRAN καταλύει τη ΝΜΡυλίωση άλλων πρωτεϊνών.Δημιουργήσαμε ένα σύνολο δυνητικών ομόλογων στόχων, συμπεριλαμβανομένων μη δομικών πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται από HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), που το καθένα περιέχει μια C-τερματική ετικέτα His6 (παράρτημα SI, Πίνακας S1) και επωάστε αυτές τις πρωτεΐνες με [α32-Ρ] τριφωσφορική ουριδίνη ([α32-Ρ]UTP) παρουσία ή απουσία nsp12.Η λευκωματίνη ορού βοοειδών και η πρωτεΐνη σύντηξης ΜΒΡ-LacZa που παρήχθη σε Ε. coli χρησίμευσαν ως μάρτυρες (Εικόνα 2Α, λωρίδες 1 έως 7).Η ραδιοσημασμένη πρωτεΐνη αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και αυτοραδιογραφία, και βρέθηκε ότι υπήρχε ισχυρό ραδιενεργό σήμα στην αντίδραση που περιείχε nsp12 και nsp9.Η θέση του σήματος αντιστοιχεί στη μοριακή μάζα του nsp9, υποδεικνύοντας την προκαλούμενη από nsp12 UMPylation του nsp9 (Εικόνα 2Β, διαδρομή 7).Καμία άλλη δοκιμαστική πρωτεΐνη δεν βρέθηκε να είναι UMPylated, γεγονός που μας οδήγησε στο συμπέρασμα ότι το nsp9 είναι ένα συγκεκριμένο υπόστρωμα του nsp12.Σύμφωνα με τα δεδομένα αυτο-ΝΜΡυλίωσης που φαίνονται στο Σχήμα 1, το nsp12 μπορεί να μεταφέρει και τα τέσσερα NMP στο nsp9, αν και η απόδοση είναι διαφορετική, UMP> μονοφωσφορική αδενοσίνη (AMP)> μονοφωσφορική γουανοσίνη (GMP)> μονοφωσφορική κυτιδίνη (CMP) Εικόνα).3 Α και Β).Υπό τις συνθήκες που χρησιμοποιούνται σε αυτήν τη δοκιμασία (μείωση της αντίδρασης και του χρόνου έκθεσης, μείωση της συγκέντρωσης του nsp12, υλικά και μέθοδοι), η αυτο-ΝΜΡυλίωση του nsp12 δεν μπορούσε να ανιχνευθεί (συγκρίνετε Εικόνα 2Β, λωρίδα 7 και Εικόνα 1Β), η οποία αποδείχθηκε αποτελεσματικό (Και πολλαπλοί γύροι) το UMP μετακινήθηκε από το nsp12 στο nsp9.Η δραστικότητα της τρανσφεράσης UMP απαιτεί την παρουσία ιόντων Mn2+, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, ενώ μόνο ελάχιστη δραστικότητα τρανσφεράσης UMP παρατηρήθηκε παρουσία Mg2+ και καμία δραστηριότητα παρουσία των άλλων δύο δισθενών κατιόντων που δοκιμάστηκαν.Παρόμοια δεδομένα ελήφθησαν σε προσδιορισμούς ΝΜΡυλίωσης που περιέχουν τριφωσφορική κυτιδίνη (CTP), τριφωσφορική γουανοσίνη (GTP) και τριφωσφορική αδενοσίνη (ATP) (παράρτημα SI, Εικόνα S1).
HCoV-229E nsp12 UMPylation του nsp9.Μια σειρά πρωτεϊνικών υποστρωμάτων (συμπεριλαμβανομένης της αλβουμίνης ορού βοοειδών, MBP-lacZa και μιας σειράς HCoV-229E nsps επισημασμένων με C-τερματικό His6 που κωδικοποιείται από ORF1a) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της δραστηριότητας UMPylation του HCoV-229E nsp12-His6+ πρωτεΐνη.Επωάστε την πρωτεΐνη με [α-32P] UTP για 10 λεπτά απουσία (Α) ή παρουσία (Β) nsp12 όπως περιγράφεται στα υλικά και τις μεθόδους.Στο επάνω μέρος των Α και Β, εμφανίζεται γέλη SDS-πολυακρυλαμιδίου βαμμένη με Coomassie Brilliant Blue και στο κάτω μέρος των Α και Β, φαίνονται τα αντίστοιχα αυτοραδιογραφήματα.Η θέση του δείκτη μοριακής μάζας πρωτεΐνης (σε kilodaltons) δίνεται στα αριστερά.Υποδεικνύεται επίσης η θέση του nsp12-His6 (B, επάνω) και το ραδιενεργό σήμα που παρατηρήθηκε κατά την επώαση του nsp12-His6 με nsp9-His6 (B, λωρίδα 7), γεγονός που υποδεικνύει ότι [α-32P]UMP σε nsp9-His6 (12,9 kDa), το οποίο δεν παρατηρήθηκε για άλλες πρωτεΐνες που δοκιμάστηκαν.
HCoV-229E Βιοχημικός και ιολογικός χαρακτηρισμός της nsp9 NMPylation με τη μεσολάβηση NiRAN.(Α και Β) Ο ρόλος του συν-υποστρώματος νουκλεοτιδίου που χρησιμοποιείται στην αντίδραση.Τα Nsp12-His6 και nsp9-His6 αναμειγνύονται και επωάζονται παρουσία διαφορετικών [α-32P] NTP στον τυπικό προσδιορισμό ΝΜΡυλίωσης.(Α, επάνω) nsp9-His6 χρωματισμένο με Coomassie διαχωρισμένο με SDS-PAGE.(Α, κάτω) Αυτοραδιογραφία της ίδιας περιοχής της γέλης.(Β) Η σχετική δραστικότητα (μέση τιμή ± SEM) παρουσία του καθορισμένου συμπαράγοντα νουκλεοτιδίου προσδιορίζεται από τρία ανεξάρτητα πειράματα.*P≤0,05.(Γ) Ο ρόλος των μεταλλικών ιόντων.Εμφανίζεται η τυπική δοκιμή NMPylation παρουσία [α-32P] UTP και διαφορετικών μεταλλικών ιόντων, το καθένα με συγκέντρωση 1 mM.Στο C, το επάνω μέρος, το nsp9-His6 με χρώση Coomassie, και στο C, το κάτω μέρος, εμφανίζεται η αντίστοιχη αυτοραδιογραφία.Το μέγεθος της επισημασμένης πρωτεΐνης (σε kilodaltons) φαίνεται στα αριστερά των A και C. (D) Η μεταλλαγμένη μορφή του HCoV-229E nsp12-His6 που φέρει την καθορισμένη υποκατάσταση αμινοξέος είναι σε [α-32P]UTP, όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι.Το ραδιοσημασμένο nsp9-His6 που παράγεται στην αντίδραση ΝΜΡυλίωσης ανιχνεύεται με απεικόνιση φωσφορυλίωσης (D, top).Η σχετική δραστηριότητα σε σύγκριση με την άγριου τύπου (wt) πρωτεΐνη φαίνεται στο D, και το κάτω μέρος λαμβάνεται ως ο μέσος όρος (±SEM) από τρία ανεξάρτητα πειράματα.Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν αντικαταστάσεις μη διατηρημένων υπολειμμάτων.(Ε) Ο τίτλος του ιού στο υπερκείμενο καλλιέργειας των κυττάρων ρ1 που ελήφθη 24 ώρες μετά τη μόλυνση προσδιορίστηκε με ανάλυση πλάκας.Υποδεικνύονται οι υποκαταστάσεις κωδικονίων στον τομέα NiRAN του μεταλλαγμένου HCoV-229E που έχει κατασκευαστεί (η αρίθμηση των υπολειμμάτων βασίζεται στη θέση τους στο pp1ab).Ως έλεγχος χρησιμοποιήθηκε το μεταλλαγμένο ενεργό σημείο RdRp με έλλειψη αντιγραφής nsp12_DD4823/4AA.
Προκειμένου να αποκτήσουμε μια βαθύτερη κατανόηση της ενεργού θέσης του NiRAN και να προσδιορίσουμε τα υπολείμματα που σχετίζονται με τη δραστηριότητα της ειδικής για το nsp9 NMP τρανσφεράσης, πραγματοποιήσαμε ανάλυση μετάλλαξης, στην οποία αντικαταστήσαμε τα συντηρητικά υπολείμματα στα μοτίβα NiRAN AN, BN και CN ( 16) Είναι Ala (παράρτημα SI, Εικόνα S2).Επιπλέον, η επίδραση των συντηρητικών αντικαταστάσεων Arg-to-Lys ή Lys-to-Arg αξιολογήθηκε σε δύο περιπτώσεις.Ως (αρνητικός) έλεγχος, τα υπολείμματα που δεν είναι ή λιγότερο διατηρημένα στον τομέα NiRAN των κοροναϊών και άλλων ένθετων ιών αντικαθίστανται με Ala. Αντικαθιστώντας το K4116A (στο μοτίβο preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (μοτίβο Οι BN) και D4280A (CN) μειώνουν σημαντικά ή και εξαλείφουν την nsp9 NMPylation μέσω της nsp12, ενώ οι πρωτεΐνες με συντηρητικές υποκαταστάσεις (R4178K), K4116R) διατηρούν το 60% και το 80% της δραστηριότητάς τους, γεγονός που υποδηλώνει ότι η χαλάρωση των περιορισμών στην αντίστοιχη πλευρά τους Οι αλυσίδες είναι φυσικοχημικά ευαίσθητες (Εικόνα 3D).Η αντικατάσταση πολλών άλλων διατηρημένων υπολειμμάτων E4145A, D4273A, F4281A και D4283A είναι πολύ λιγότερο επιβλαβής και η nsp9 UMPylation μειώνεται μόνο μέτρια.Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε αντιδράσεις nsp9 ΝΜΡυλίωσης που περιλαμβάνουν άλλα NTPs (Εικόνα 3D και παράρτημα SI, Εικόνα S3), επιβεβαιώνοντας ότι οι παρατηρούμενες επιδράσεις σε συγκεκριμένες υποκαταστάσεις αμινοξέων είναι ανεξάρτητες από τον τύπο του χρησιμοποιούμενου συν-υποστρώματος νουκλεοτιδίου.Στη συνέχεια, δοκιμάσαμε την πιθανή επίδραση αυτών των αντικαταστάσεων nsp12 στην αντιγραφή των κοροναϊών σε κυτταροκαλλιέργεια.Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε κατάλληλα γενετικά τροποποιημένα πρότυπα συμπληρωματικού DNA (cDNA) κλωνοποιημένα σε ανασυνδυασμένο ιό δαμαλίτιδας (23, 24) για τη μεταγραφή 5-7 κυττάρων.Η τιτλοποίηση των απογόνων μολυσματικών ιών που παράγονται σε αυτά τα κύτταρα έδειξε ότι οι περισσότερες μεταλλάξεις NiRAN HCoV-229E δεν ήταν εφικτές (Εικόνα 3Ε).Μια ομάδα μη βιώσιμων ιικών μεταλλαγμάτων περιλαμβάνει εναλλακτικές που έχει αποδειχθεί ότι εξαλείφουν ή μειώνουν σημαντικά τη δραστηριότητα της τρανσφεράσης NMP in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), αλλά υπάρχουν δύο άλλες εναλλακτικές (K4116R, E48145A) % κατοχυρωμένα?Η in vitro δραστηριότητα ΝΜΡυλίωσης τους υποδηλώνει ότι εμπλέκονται πρόσθετοι περιορισμοί.Ομοίως, δύο άλλες μεταλλάξεις (R4178K, F4281A) που προκάλεσαν μια μέτρια μείωση της in vitro δραστηριότητας ΝΜΡυλίωσης του NiRAN παρήγαγαν ζωντανούς ιούς, ωστόσο, αυτοί οι ιοί μείωσαν σημαντικά τους τίτλους μέσω της αντιγραφής.Σε συμφωνία με τα δεδομένα δραστηριότητας in vitro που φαίνονται στο Σχήμα 3D, αντικαθιστώντας τέσσερα άλλα υπολείμματα που δεν διατηρούνται στον κορωνοϊό και/ή άλλους ένθετους ιούς (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) παρήγαγαν βιώσιμους ιούς Οι απόγονοι, παρά το γεγονός ότι είχαν έναν μετρίως μειωμένο τίτλο σε σύγκριση με τον ιό άγριου τύπου (Εικόνα 3Ε).
Προκειμένου να μελετηθεί εάν η δραστικότητα NMP τρανσφεράσης με τη μεσολάβηση NiRAN εξαρτάται από τον ενεργό τομέα RdRp, τα δύο διατηρημένα υπολείμματα Asp που εμπλέκονται στο συντονισμό των δισθενών ιόντων μετάλλων (11) στο μοτίβο RdRp C αντικαταστάθηκαν από το Ala. Η προκύπτουσα πρωτεΐνη nsp12_DD4823/4AA διατηρεί Η δραστικότητα nsp9 ΝΜΡυλίωσης του, υποδεικνύοντας ότι η δράση in vitro nsp9 NMPυλίωσης που προκαλείται από nsp12 δεν απαιτεί δραστηριότητα πολυμεράσης (Παράρτημα SI, Εικόνα S4).
Μετά τον καθορισμό της δραστικότητας NMP τρανσφεράσης ειδικής για nsp9 για το nsp12, προσπαθήσαμε να χαρακτηρίσουμε το προϊόν προσθήκης NMP-nsp9 με φασματομετρία μάζας (MS).Το πλήρες φάσμα μάζας πρωτεΐνης του ανασυνδυασμένου HCoV-229E nsp9 έδειξε μια κορυφή στα 12.045 Da (Εικόνα 4Α).Η προσθήκη του nsp12 δεν άλλαξε την ποιότητα του nsp9, υποδεικνύοντας ότι τα nsp12 και nsp9 δεν θα σχημάτιζαν ένα σταθερό σύμπλοκο υπό τις συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν (μετουσίωσης) (Εικόνα 4Α).Παρουσία UTP και GTP, η μέτρηση μάζας της αντίδρασης που περιέχει nsp9 και nsp12 αντίστοιχα έδειξε ότι η πρωτεϊνική μάζα του UTP μετακινήθηκε κατά 306 Da, και η μάζα πρωτεΐνης του GTP μετακινήθηκε κατά 345 Da, υποδεικνύοντας ότι κάθε μόριο nsp9 δεσμεύει ένα UMP ή GMP (Εικόνα 4) Γ και Δ).Εικάζεται ότι η ενέργεια που απαιτείται για τη μεσολάβηση του NiRAN nsp9 NMPylation προέρχεται από την υδρόλυση NTP και την απελευθέρωση πυροφωσφορικού.Παρόλο που χρησιμοποιήθηκε 10πλάσια μοριακή περίσσεια nsp9 (στόχος) από το nsp12 (ένζυμο) σε αυτήν την αντίδραση, παρατηρήθηκε σχεδόν πλήρης NMPυλίωση του nsp9, υποδεικνύοντας ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ nsp12 και nsp9 είναι βραχύβια και το nsp12 μπορεί να NMPylate περισσότερο nsp9 in vitro μόριο.
Απλή NMPυλίωση του nsp9 παρουσία nsp12 και UTP ή GTP.Εμφανίζεται το αποσυνελιγμένο πλήρες φάσμα μάζας πρωτεΐνης του HCoV-229E nsp9 (παράρτημα SI, Πίνακας S1) (AD).(Α) nsp9 μόνο, (Β) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 παρουσία UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 παρουσία GTP.
Για τον προσδιορισμό των υπολειμμάτων nsp9 UMPυλιώθηκε με nsp12, το nsp9-UMP διασπάστηκε με θρυψίνη.Τα προκύπτοντα πεπτίδια διαχωρίστηκαν με υγρή χρωματογραφία νανο-υψηλής απόδοσης (HPLC) και αναλύθηκαν με διαδοχική φασματομετρία μάζας (MS/MS) online.Η ανάλυση δεδομένων χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού Byonic (Protein Metrics) έδειξε UMPylation του Ν-τερματικού αμινοξέος.Αυτό επιβεβαιώνεται χειροκίνητα.Το διαδοχικό φάσμα μάζας του προδρόμου πεπτιδίου [UMP]NNEIMPGK (προσάρτημα SI, Εικόνα S5A) αποκάλυψε ένα θραύσμα στα 421 m/z, υποδεικνύοντας ότι το UMP δεσμεύεται στο υπόλειμμα 1 του nsp9.
Στο Ν-άκρο του nsp9, το Asn διατηρείται μεταξύ των μελών του Orthocoronavirinae (προσάρτημα SI, Εικόνα S6).Αν και πιστεύουμε ότι το Ν-τερματικό πρωτοταγές αμινο άζωτο είναι ο πιο πιθανός αποδέκτης για το UMP, αποφασίσαμε να αποκτήσουμε πρόσθετες ενδείξεις δέσμευσης NMP στο Ν-τερματικό άκρο.Για το λόγο αυτό, το μη ΝΜΡυλιωμένο και ΝΜΡυλιωμένο Ν-τερματικό πεπτίδιο nsp9 που καθαρίστηκε με HPLC προήλθε παρουσία ακετόνης και κυανοβοροϋδριδίου του νατρίου.Υπό αυτές τις συνθήκες, μόνο ελεύθερες πρωτοταγείς αμίνες μπορούν να τροποποιηθούν με προπύλιο (25).Το πεπτίδιο που προέρχεται από το Ν-τερματικό nsp9 με την αλληλουχία NNEIMPGK περιέχει δύο πρωτοταγείς αμίνες, μία στο Ν-άκρο του Asn και την άλλη στην πλευρική αλυσίδα του Lys στο Ο-άκρο.Επομένως, μπορούν να εισαχθούν ομάδες προπυλίου και στα δύο άκρα.Τα εκχυλισμένα ιόντα χρωματογραφήματα μη-ΝΜΡυλιωμένων πεπτιδίων φαίνονται στο παράρτημα SI, Εικόνα S5B.Όπως αναμενόταν, μπορούν να αναγνωριστούν αμινοτελικά και καρβοξυτελικά (μονο)προπυλιωμένα (προσάρτημα SI, Εικόνα S5B, άνω λωρίδα) και διπροπυλιωμένα πεπτίδια (προσάρτημα SI, Εικόνα S5B, κάτω λωρίδα).Αυτό το πρότυπο αλλάζει με τη χρήση του ΝΜΡυλιωμένου Ν-τερματικού πεπτιδίου του nsp9.Σε αυτήν την περίπτωση, μπορούν να αναγνωριστούν μόνο τα καρβοξυτελικά προπυλιωμένα πεπτίδια, αλλά τα Ν-τερματικά προπυλιωμένα πεπτίδια και τα διπροπυλιωμένα πεπτίδια δεν ταυτοποιούνται (Παράρτημα SI, Εικόνα S5C), υποδεικνύοντας ότι το UMP έχει μεταφερθεί στη Ν-τερματική πρωτοταγή αμίνη Για να αποφευχθεί αυτό ομάδα από την πραγματοποίηση αλλαγών.
Στη συνέχεια, αντικαθιστούμε (με Ala ή Ser) ή διαγράφουμε τα διατηρημένα υπολείμματα στο Ν-τελικό άκρο του nsp9 για να ορίσουμε περιορισμούς για συγκεκριμένους στόχους.Με βάση τα δεδομένα MS μας που δείχνουν ότι το NiRAN σχηματίζει ένα προϊόν προσθήκης nsp9-NMP με την πρωτοταγή αμίνη του Ν-τερματικού υπολείμματος του nsp9, υποθέσαμε ότι η nsp9 NMPylation απαιτεί την κύρια πρωτεάση του ιού (Mpro, nsp5) για την απελευθέρωση του nsp9 Ν-τελικού από ο πρόδρομος πολυπρωτεΐνης του.Για να ελέγξουμε αυτήν την υπόθεση, δημιουργήσαμε μια πρόδρομη πρωτεΐνη nsp7-11 που περιέχει nsp9 σε E. coli και πραγματοποιήσαμε μια τυπική δοκιμή NMPylation παρουσία [α-32P] UTP (υλικά και μέθοδοι).Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α (λωρίδα 3), ο μη κομμένος πρόδρομος nsp7-11 δεν είναι ραδιοσημασμένος με nsp12.Αντίθετα, εάν το nsp7-11 διασπαστεί από ανασυνδυασμένο nsp5 για να απελευθερώσει nsp9 (και άλλα nsps) από τον πρόδρομο, ανιχνεύεται μια ραδιοσημασμένη πρωτεΐνη που μεταναστεύει με το nsp9, επιβεβαιώνοντας το συμπέρασμά μας ότι NiRAN και N-Επιλεκτικός σχηματισμός ομοιοπολικών προσαγωγών nsp9-NMP .Η τελική πρωτοταγής αμίνη του Ν-τερματικού Asn (θέση 3825 σε pp1a/pp1ab).Αυτό το συμπέρασμα υποστηρίζεται επίσης από πειράματα που χρησιμοποιούν το κατασκεύασμα nsp9, το οποίο περιέχει ένα ή δύο επιπλέον υπολείμματα στο Ν-άκρο.Και στις δύο περιπτώσεις, η προκαλούμενη από NiRAN UMPylation του nsp9 καταργήθηκε (Παράρτημα SI, Εικόνα S7).Στη συνέχεια, παράγαμε μια πρωτεΐνη με ένα ή δύο υπολείμματα Asn που έχουν διαγραφεί από την πεπτιδική αλληλουχία 3825-NNEIMPK-3832 στο Ν-τελικό άκρο του nsp9.Και στις δύο περιπτώσεις, η nsp9 UMPylation αποκλείστηκε πλήρως (Εικόνα 5Β), παρέχοντας πρόσθετες ενδείξεις ότι το πραγματικό nsp9 Ν-άκρο δρα ως υποδοχέας NMP.
Η πρωτεολυτική επεξεργασία του nsp9 και ο ρόλος των Ν-τερματικών υπολειμμάτων στη διαμεσολαβούμενη από nsp12 UMPylation.(Α) Η nsp9 UMPylation απαιτεί ένα ελεύθερο nsp9 Ν-τελικό.Το Nsp7-11-His6 προεπωάζεται στους 30 °C σε ρυθμιστικό διάλυμα ανίχνευσης NMPylation που περιέχει UTP παρουσία ή απουσία ανασυνδυασμένου Mpro (nsp5-His6).Μετά από 3 ώρες, ξεκινήστε τον προσδιορισμό NMPylation προσθέτοντας nsp12-His6 όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι.Η αντίδραση που περιείχε nsp5-His6 (λωρίδα 1) και nsp9-His6 (λωρίδα 2) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.Μετά από 10 λεπτά, η αντίδραση τερματίστηκε και το μίγμα της αντίδρασης διαχωρίστηκε με SDS-PAGE.Η πρωτεΐνη χρωματίστηκε με Coomassie Brilliant Blue (Α, κορυφή).Ο πρόδρομος Nsp7-11-His6 και το επεξεργασμένο προϊόν που προκύπτει από τη διάσπαση με τη μεσολάβηση nsp5-His6 φαίνονται στα δεξιά.Σημειώστε (λόγω του μικρού τους μεγέθους) ότι τα nsp7 και nsp11-His6 δεν είναι ανιχνεύσιμα σε αυτό το πήκτωμα και η αντίδραση συμπληρώνεται με nsp5-His6 (λωρίδες 1 και 4, η θέση του nsp5-His6 υποδεικνύεται με έναν συμπαγή κύκλο) ή το nsp9-His6 (Λωρίδα 2) περιέχει μια μικρή ποσότητα ΜΒΡ (που υποδεικνύεται με ανοιχτούς κύκλους) ως υπολειμματικές ακαθαρσίες επειδή εκφράζονται ως πρωτεΐνες σύντηξης ΜΒΡ (παράρτημα SI, Πίνακας S1).(Β) Η παραλλαγή Nsp9-His6 στερείται ενός ή δύο Ν-τερματικών υπολειμμάτων Asn (αρίθμηση υπολειμμάτων σύμφωνα με τη θέση σε pp1a/pp1ab) και καθαρίζεται και επωάζεται με nsp12-His6 και [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE βαμμένο με Coomassie φαίνεται στο επάνω μέρος, B, το αντίστοιχο αυτοραδιογράφημα φαίνεται στο κάτω μέρος.Η θέση του δείκτη μοριακού βάρους (σε kilodaltons) φαίνεται στα αριστερά.(Γ) Τα διατηρημένα υπολείμματα του Ν-τερματικού HCoV-229E nsp9-His6 αντικαταστάθηκαν με Ala ή Ser και η ίδια ποσότητα πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε στην αντίδραση UMPylation με τη μεσολάβηση nsp12-His6.Τα προϊόντα της αντίδρασης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και χρωματίστηκαν με Coomassie Brilliant Blue (C, επάνω), και το ραδιοσημασμένο nsp9-His6 ανιχνεύθηκε με απεικόνιση φωσφορισμού (C, μέση).Χρησιμοποιώντας πρωτεΐνη άγριου τύπου (wt) ως αναφορά (ρυθμίστηκε στο 100%), η σχετική δραστηριότητα ΝΜΡυλίωσης (μέσος όρος ± SEM) υπολογίστηκε από τρία ανεξάρτητα πειράματα.(D) Οι τίτλοι του ιού στο υπερκείμενο κυτταροκαλλιέργειας p1 των κυττάρων Huh-7 που έχουν μολυνθεί με κύτταρα Huh-7 άγριου τύπου HCoV-229E και των μεταλλαγμάτων που φέρουν καθορισμένες υποκαταστάσεις αμινοξέων στο nsp9 προσδιορίστηκαν με ανάλυση πλάκας.Ως αρνητικός έλεγχος χρησιμοποιήθηκε το μοτίβο RdRp με ανεπάρκεια αντιγραφής C διπλό μετάλλαγμα DD4823/4AA.
Το Ν-άκρο του nsp9 (ειδικά οι θέσεις 1, 2, 3 και 6) είναι πολύ διατηρημένο μεταξύ των μελών της υποοικογένειας Orthocoronavirinae (παράρτημα SI, Εικόνα S6).Προκειμένου να μελετηθεί ο πιθανός ρόλος αυτών των υπολειμμάτων στη διαμεσολαβούμενη από nsp12 nsp9 ΝΜΡυλίωση, δύο διαδοχικά υπολείμματα Asn στο Ν-άκρο του nsp9 αντικαταστάθηκαν με Ala ή Ser (μόνο ή σε συνδυασμό).Σε σύγκριση με το nsp9 άγριου τύπου, η αντικατάσταση του N3825 με Ala ή Ser είχε ως αποτέλεσμα περισσότερο από δύο φορές μείωση της UMPylation που προκαλείται από nsp12 (Εικόνα 5C).Σε συμφωνία με το συμπέρασμά μας ότι η ΝΜΡυλίωση λαμβάνει χώρα στη Ν-τερματική πρωτοταγή αμίνη αντί της πλευρικής αλυσίδας του Ν-τερματικού υπολείμματος, παρατηρήσαμε σημαντική υπολειμματική ΝΜΡυλίωση με την αντικατάσταση των N3825A και N3825S.Είναι ενδιαφέρον ότι εάν το δεύτερο Asn αντικατασταθεί από Ala ή Ser, η nsp9 UMPylation μειώνεται πιο έντονα (πάνω από 10 φορές), ενώ η αντικατάσταση του Ala στις θέσεις 3, 4 και 6 έχει μόνο μέτρια επίδραση στην nsp9 UMPylation (Εικόνα 2 ) .5C).Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ATP, CTP ή GTP (παράρτημα SI, Εικόνα S8).Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν τον βασικό ρόλο του N2826 (θέση 2 στο nsp9) στην nsp9 NMPylation.
Προκειμένου να λάβουμε πρόσθετα στοιχεία της λειτουργικής συσχέτισης μεταξύ του Ν-άκρου του nsp9 και της NMPylation, πραγματοποιήσαμε μια ευθυγράμμιση πολλαπλών ακολουθιών (MSA) της αλληλουχίας nsp9 της οικογένειας Coronavirus (που ποικίλλει μεταξύ 104 και 113 υπολειμμάτων) (Παράρτημα SI, Εικόνα S6).Συνολικά, σε 47 (γνωστά και υποτιθέμενα) είδη 5 γενών της υποοικογένειας Orthocoronavirinae που μολύνουν διαφορετικά θηλαστικά, πτηνά και ξενιστές ερπετών, μόνο 8 συνολικά υπολείμματα βρέθηκαν να είναι αμετάβλητα.Οι πιο εκτεταμένες αλλαγές, συμπεριλαμβανομένων των διαγραφών και των εισαγωγών, παρατηρήθηκαν στους κύκλους μεταξύ των δευτερογενών δομικών στοιχείων του nsp9, όπως καθορίστηκε από προηγούμενες δομικές μελέτες (26 ??28).Πέντε αμετάβλητα υπολείμματα βρέθηκαν στον β κλώνο και στην α έλικα του Ο-τελικού τμήματος του nsp9.Τρία αμετάβλητα υπολείμματα αποτελούν το μοτίβο NNE του Ν άκρου του nsp9.Αποκαλύπτεται ότι το δεύτερο Asn αυτού του μοτίβου είναι το μόνο αμετάβλητο υπόλειμμα, το οποίο μοιράζεται επίσης το υποθετικό nsp9 του απομακρυσμένα συγγενή κορωνοϊού βατράχου και αντιπροσωπεύει το είδος Microhyla letovirus 1 στην υποοικογένεια Letovirinae του Alphaletovirus.Η διατήρηση των υπολειμμάτων σε στοιχεία δευτερεύουσας δομής nsp9 μπορεί να εξορθολογιστεί με δομικές εκτιμήσεις για τη διατήρηση των αναδιπλούμενων ή γνωστών ιδιοτήτων σύνδεσης RNA.Ωστόσο, αυτός ο συλλογισμός δεν φαίνεται να ισχύει για τη διατήρηση του NNE και πριν από αυτή τη μελέτη, η φύση των περιορισμών που περιορίζουν την παραλλαγή της τριπεπτιδικής αλληλουχίας ήταν εντελώς συγκαλυμμένη.
Προκειμένου να προσδιοριστεί η σημασία της nsp9-NMPylation και της διατήρησης NNE στην αντιγραφή του κοροναϊού, παράγαμε μεταλλάκτες HCoV-229E, οι οποίοι φέρουν μονές ή διπλές αντικαταστάσεις των nsp9 Ν-τερματικών υπολειμμάτων, υποδεικνύοντας ότι η nsp9 NMPylation είναι επιβλαβής in vitro.Πριν ξεκινήσουμε, προσπαθούμε να απαντήσουμε στο ερώτημα εάν αυτές οι υποκαταστάσεις (κοντά στη θέση διάσπασης nsp8|9) επηρεάζουν την πρωτεολυτική επεξεργασία της C-τερματικής περιοχής pp1a.Ένα σύνολο κατασκευών πολυπρωτεϊνών nsp7-11 που περιέχουν αντίστοιχες υποκαταστάσεις στο Ν-άκρο του nsp9 παρήχθη σε Ε. coli και κόπηκε με ανασυνδυασμένο Mpro.Η πρωτεολυτική διάσπαση των τεσσάρων θέσεων (συμπεριλαμβανομένης της πλευρικής θέσης nsp9) δεν επηρεάζεται σημαντικά από τυχόν εισαγόμενες υποκαταστάσεις (παράρτημα SI, Εικόνα S9), εξαιρουμένων των δομικών αλλαγών σε αυτές τις πρωτεΐνες που παρεμβαίνουν στη διάσπαση nsp8|9 που προκαλείται από Mpro (ή άλλη) δικτυακός τόπος.
Τα κύτταρα Huh-7 επιμολύνθηκαν με RNA HCoV-229E μήκους γονιδιώματος, που κωδικοποιεί υποκαταστάσεις Ala ή Ser στα συντηρημένα τριπεπτίδια NNE (N3825, N3826 και E3827) στο άκρο nsp9 N, δείχνοντας ότι οι περισσότερες μεταλλάξεις είναι θανατηφόρες.Μπορέσαμε να σώσουμε τον ιό αντικαθιστώντας το Ser ή Ala του Ν-τερματικού Asn (N2835A ή N2835S), αλλά δεν καταφέραμε να ανακτήσουμε τον ιό με άλλες απλές και διπλές μεταλλάξεις στην ακολουθία NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (Εικόνα 5D).
Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ο πολλαπλασιασμός των κοροναϊών στην ιστοκαλλιέργεια είναι περιορισμένος (ίδιος ή παρόμοιος), περιορίζοντας τη φυσική μετάλλαξη των θέσεων nsp9 NMPylation στο σώμα και υποστηρίζοντας τον βασικό ρόλο αυτής της απόκρισης στον κύκλο ζωής των κοροναϊών.
Στο τελευταίο σύνολο πειραμάτων, παράγαμε το C-τερματικό His6 με επισήμανση SARS-CoV-2 nsp12 και nsp9 και δύο μεταλλαγμένες μορφές nsp12 στο E. coli.Τα υπολείμματα ενεργού θέσης στις περιοχές NiRAN και RdRp ήταν αντίστοιχα Use Ala (Εικόνα 6Α και παράρτημα SI, Πίνακας S2).Το K4465 στο SARS-CoV-2 nsp12 αντιστοιχεί στο K4135 στο HCoV-229E (Παράρτημα SI, Εικόνα S2), το οποίο αποδείχθηκε ότι απαιτείται για τη δραστηριότητα NiRAN και την αντιγραφή του HCoV-229E (Εικόνα 3D και E).Αυτό το υπόλειμμα αντιστοιχεί επίσης στο υπόλειμμα αρτηριακού ιού EAV nsp9 K94, το οποίο είχε αποδειχθεί προηγουμένως απαραίτητο για αυτο-UMPylation/self-GMPylation NiRAN (16).Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Β, το SARS-CoV-2 nsp12 έχει δραστηριότητα τρανσφεράσης UMP χρησιμοποιώντας το nsp9 ως υπόστρωμα, ενώ το μεταλλαγμένο ενεργό σημείο nsp12_K4465A είναι ανενεργό.Η διπλή υποκατάσταση στη χαρακτηριστική αλληλουχία SDD του μοτίβου C RdRp δεν επηρεάζει τη δραστηριότητα της τρανσφεράσης UMP (Εικόνα 6Β), υποδεικνύοντας ότι η δραστηριότητα RdRp δεν έχει άμεση επίδραση στην nsp9 UMPylation.Παρόμοια δεδομένα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας CTP, GTP και ATP (παράρτημα SI, Εικόνα S10).Συνοπτικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η μεσολαβούμενη από NiRAN nsp9 NMPylation έχει μια συντηρητική δραστηριότητα σε κοροναϊούς που αντιπροσωπεύουν διαφορετικά γένη της υποοικογένειας των ορθοκορωνοϊών.
ΝΜΡυλίωση του nsp9 με τη μεσολάβηση SARS-CoV-2 nsp12.(Α) Χρωματισμένη με Coomassie γέλη SDS-πολυακρυλαμιδίου που δείχνει την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη που χρησιμοποιείται στη δοκιμή NMPylation.Ως έλεγχος, χρησιμοποιήθηκε μια μεταλλαγμένη πρωτεΐνη με υποκατάσταση ενεργού θέσης στον τομέα NiRAN (K4465A) και στον τομέα RdRp (DD5152/3AA) του SARS-CoV-2 nsp12.Η αρίθμηση υπολειμμάτων βασίζεται στη θέση στο pp1ab.(Β) Αυτοραδιογραφία ανίχνευσης UMPylation χρησιμοποιώντας nsp9-His6 και [α-32P]UTP ως υπόστρωμα του nsp12-His6 (άγριου τύπου [wt] και μεταλλαγμένο).Η μοριακή μάζα (σε kilodaltons) της επισημασμένης πρωτεΐνης φαίνεται στα αριστερά.
Οι περιοχές NiRAN γενικά διατηρούνται στο Nidovirales (16), υποδεικνύοντας ότι καταλύουν ενζυματικές αντιδράσεις απαραίτητες για την αντιγραφή του Nidovirus.Σε αυτή τη μελέτη, μπορέσαμε να αποδείξουμε ότι ο τομέας NiRAN του κορωνοϊού μεταφέρει το NMP (που δημιουργείται από NTP) στο nsp9, μια μυστηριώδη πρωτεΐνη δέσμευσης RNA που εμπλέκεται στην αντιγραφή του ιού (26 ?? 29 ), για να τον προσδιορίσει ως φυσικό στόχο και συνεργάτης του coronavirus RTC.
Ο τομέας NiRAN μοιράζεται τρία μοτίβα αλληλουχίας (AN, BN και CN), τα οποία περιέχουν έναν πολύ μικρό αριθμό υπολειμμάτων που διατηρούνται σε όλες τις οικογένειες της μονοφυλετικής αλλά εξαιρετικά διαφοροποιημένης τάξης Nidovirales (8, 16) .Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι σχετίζονται δομικά με μια σε μεγάλο βαθμό αχαρακτήριστη οικογένεια πρωτεϊνών που μοιάζουν με κινάση πρωτεΐνης, η οποία αρχικά ονομαζόταν οικογένεια SelO (17, 19, 22, 30, 31).Οι πρωτεΐνες που σχετίζονται με το SelO έχουν πτυχές κινάσης, αλλά στερούνται αρκετά διατηρημένων υπολειμμάτων ενεργών θέσεων στις κλασικές κινάσες (22, 32).Με βάση τον αντίστροφο προσανατολισμό των μορίων ATP που συνδέονται με την ενεργό θέση και σταθεροποιούνται από συγκεκριμένες αλληλεπιδράσεις, το SelO υποτέθηκε και στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε ότι μεταφέρει AMP (αντί για φωσφορικό) στο πρωτεϊνικό υπόστρωμα (22), ενώ μια άλλη βακτηριακή πρωτεΐνη που μοιάζει με SelO YdiU έχει πρόσφατα αποδείχθηκε ότι καταλύει την ομοιοπολική σύνδεση του UMP στα υπολείμματα Tyr και His διαφορετικών πρωτεϊνικών υποστρωμάτων (33).
Προκειμένου να επιβεβαιώσουμε και να επεκτείνουμε την πρόβλεψη των υπολειμμάτων της πιθανής ενεργής θέσης του τομέα NiRAN του κορωνοϊού, χρησιμοποιήσαμε μεθόδους βιοχημικής και αντίστροφης γενετικής για να πραγματοποιήσουμε ανάλυση μετάλλαξης στον κορωνοϊό nsp12 (Εικόνα 3D και παράρτημα E και SI, Εικόνα S3 και πίνακας) S1â S4).Τα δεδομένα δείχνουν ότι η αντικατάσταση των HCoV-229E K4135, R4178 και D4280 με Ala εξαλείφει in vitro τη δραστηριότητα της τρανσφεράσης NMP και την αντιγραφή του ιού σε κυτταροκαλλιέργεια (Εικόνα 3D και E και SI παραρτήματα, Εικόνα S3), υποστηρίζοντας την παρουσία τους στη γ-φωσφορική NTP ( K4135, R4178) και ο συντονισμός των ενεργών ιόντων μετάλλων θέσης (D4280).Η αντικατάσταση E4145A της διατηρημένης Glu στο εύρος του ιού της φωλιάς των πτηνών που προβλεπόταν ότι θα σταθεροποιήσει τη θέση Κ4135 (17) αποδείχθηκε ότι εξαλείφει την αντιγραφή του ιού, αλλά παραδόξως, η δραστηριότητα διατηρήθηκε στον in vitro προσδιορισμό NMPylation (Εικόνα 3D και E και Παράρτημα SI, Εικόνα S3 και Πίνακες S1–S4).Μια παρόμοια παρατήρηση έγινε όταν η αντίστοιχη υποκατάσταση εισήχθη στο ομόλογο YdiU της Salmonella typhimurium (E130A) (33).Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν τη ρυθμιστική λειτουργία αυτού του διατηρημένου υπολείμματος παρά την καταλυτική λειτουργία.
Η αντικατάσταση του διατηρημένου υπολείμματος Phe (F4281A) εντός του εύρους του νεστοϊού στον τομέα του HCoV-229E NiRAN (8) είχε ως αποτέλεσμα μείωση της δραστηριότητας NMPylation in vitro και σημαντική μείωση στην αντιγραφή του ιού σε κυτταροκαλλιέργεια (Εικόνα 3D, E και SI) παράρτημα, Εικόνα S3).Τα δεδομένα είναι σύμφωνα με τη σημαντική ρυθμιστική λειτουργία αυτού του υπολείμματος, όπως το ομόλογο μοτίβο DFG, το υπόλειμμα Phe που παρουσιάστηκε προηγουμένως.Στις κλασικές πρωτεϊνικές κινάσες, είναι μέρος του βρόχου δέσμευσης Mg2+ και βοηθά στη συναρμολόγηση και τη ρύθμιση της σπονδυλικής στήλης;??Απαιτείται για αποτελεσματική καταλυτική δραστηριότητα (32, 34).Η αντικατάσταση με Ala και Arg για τα υπολείμματα K4116 (στο μοτίβο preAN), αντίστοιχα, εξάλειψε την ιική αντιγραφή και, όπως αναμενόταν, είχε διαφορετικές επιδράσεις στη δραστηριότητα της τρανσφεράσης NMP in vitro, ανάλογα με την πλευρική αλυσίδα αμινοξέων που εισήχθη (Εικόνα 3D και E και SI παραρτήματα , Εικόνα S3).Τα λειτουργικά δεδομένα είναι σύμφωνα με τις δομικές πληροφορίες, υποδεικνύοντας ότι αυτό το υπόλειμμα έχει δημιουργήσει μια αλληλεπίδραση με το φωσφορικό ATP (17).Στον τομέα NiRAN άλλων οικογενειών ένθετων ιών, η θέση του HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 καταλαμβάνεται από Lys, Arg ή His (8), υποδεικνύοντας ότι ο λειτουργικός περιορισμός αυτού του συγκεκριμένου υπολείμματος έχει χαλαρώσει.Η υποκατάσταση των D4188A και D4283A εξαλείφει ή μειώνει έντονα την ενζυμική δραστηριότητα και εξαλείφει την αντιγραφή του ιού (Εικόνα 3).Αυτά τα δύο υπολείμματα διατηρούνται στους περισσότερους (αλλά όχι σε όλους) ένθετους ιούς (8), υποδεικνύοντας μια σημαντική ειδική για την οικογένεια αλλά πιθανώς μη καταλυτική λειτουργία.Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν αντικαταστάσεις Ala αρκετών άλλων υπολειμμάτων Lys και Asp (K4113A, D4180A, D4197A και D4273A) που δεν διατηρούνται στις οικογένειες Coronaviridae ή σε άλλες οικογένειες Nestioviridae (8).Όπως αναμενόταν, αυτές οι υποκαταστάσεις είναι σε μεγάλο βαθμό ανεκτές, με ελαφρά μείωση της ενζυμικής δραστηριότητας και ιικής αντιγραφής σε ορισμένες περιπτώσεις (Εικόνα 3 και παράρτημα SI, Εικόνα S3).Συνολικά, τα δεδομένα μεταλλαξογένεσης του κορωνοϊού είναι πολύ συνεπή με τα δεδομένα self-GMP και αντίστροφης γενετικής του EAV NiRAN-RdRp (16), στα οποία το EAV nsp9 (ορθολόγος κορωνοϊού nsp12) το κατάλοιπο K94 (που αντιστοιχεί στο HCoV-229E K4135) λειτουργεί σημαντικές), R124 (που αντιστοιχεί στο R4178), D132 (που αντιστοιχεί στο D4188), D165 (που αντιστοιχεί στο D4280), F166 (που αντιστοιχεί στο F4281).Επιπλέον, τα δεδομένα μεταλλαξογένεσης του HCoV-229E είναι σύμφωνα και επεκτείνονται από τα προηγουμένως αναφερθέντα δεδομένα αντίστροφης γενετικής του SARS-CoV (16), εξίσου πολύ παρόμοια με αυτά που παρατηρήθηκαν για το αντίστοιχο μοτίβο CN μετάλλαξης Phe-to-Ala SARS-CoV_nsp12 φαινότυπος που περιγράφεται -F219A και HCoV-229E_F4281A (Εικόνα 3 Παράρτημα D και E και SI, Εικόνα S3 και Πίνακας S1-S4).
Σε σύγκριση με τα ορθόλογα EAV (16), τα οποία έχουν σαφή προτίμηση για UTP και GTP (στην αντίδραση αυτο-ΝΜΡυλίωσης), η μελέτη μας δείχνει ότι ο τομέας NiRAN του κορωνοϊού (που αντιπροσωπεύεται από HCoV-229E και SARS-CoV-2) μπορεί να είναι αποτελεσματικός μεταφέρθηκαν Και τα τέσσερα NMP, αν και υπάρχει μια μικρή προτίμηση για το UMP (Εικόνες 1 και 3).Η σχετικά χαμηλή εξειδίκευση του συγκεκριμένου συν-υποστρώματος NTP είναι σύμφωνη με την πρόσφατα αναφερθείσα υπερσύνθετη δομή SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13, στην οποία το ADP-Mg2+ συνδέεται με την ενεργή θέση του NiRAN, αλλά όχι με το τμήμα αδενίνης του σχηματισμού συγκεκριμένων αλληλεπιδράσεων (17).Στη μελέτη μας, ο τύπος νουκλεοτιδίου που χρησιμοποιείται στην αντίδραση ΝΜΡυλίωσης δεν έχει διαφορική επίδραση στη δραστηριότητα της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης (Παράρτημα SI, Εικόνα S3), υποδεικνύοντας ότι κανένα από αυτά τα υπολείμματα δεν σχετίζεται στενά με τη δέσμευση μιας συγκεκριμένης νουκλεοβάσης.Η δομική βάση και η πιθανή βιολογική σημασία των διαφορετικών προτιμήσεων συν-υποστρώματος NTP που παρατηρούνται στους τομείς NiRAN των κοροναϊών και των αρτηριακών ιών παραμένει προς μελέτη.μπορεί να είναι αληθινά ή μπορεί να οφείλονται στους περιορισμούς των αντίστοιχων μελετών τους.Προς το παρόν, δεν μπορεί να αποκλειστεί ότι η πιθανή δραστηριότητα NMPylator της περιοχής NiRAN του αρτηριακού ιού (σε σύγκριση με την προηγουμένως χαρακτηρισμένη δραστηριότητα αυτο-ΝΜΡυλίωσης) έχει διαφορετική προτίμηση συν-υποστρώματος, λαμβάνοντας υπόψη ότι η ομοιότητα μεταξύ του αρτηριακού και του κοροναϊού Ο τομέας NiRAN είναι στα όριά του.Σύγκριση βάσει ακολουθίας (16).Σε σύγκριση με την ψευδοκινάση SelO, η οποία χρησιμοποιεί Mg2+ ως συμπαράγοντα, η δραστηριότητα του κοροναϊού και του αρτηριακού ιού NiRAN εξαρτάται από το Mn2+ (16) (Εικόνα 3C και παράρτημα SI, Εικόνα S1).Η εξάρτηση από το Mn2+ και η προφανής προτίμηση για το UTP είναι ένα ασυνήθιστο χαρακτηριστικό των πρωτεϊνικών NMPylators, και μόλις πρόσφατα επιβεβαιώθηκε στην πρωτεΐνη YdiU της Salmonella typhimurium, η οποία καταλύει την αυστηρή εξαρτώμενη από Mn2+ πρωτεϊνική συνοδό UMPylation για την προστασία των κυττάρων από την επαγωγή στρες Δεξαμενή κυτταρικού ATP ( 33).
Η πρόσφατα περιγραφείσα δομική ομοιότητα μεταξύ του τομέα NiRAN του κορωνοϊού και των κυτταρικών πρωτεϊνικών κινασών (17, 19) παρέχει πρόσθετη υποστήριξη για την ικανότητα του NiRAN να συνδέει ομοιοπολικά το NMP με άλλες πρωτεΐνες που έχουμε αναφέρει σε αυτή τη μελέτη.Επικεντρώσαμε την αναζήτησή μας για πιθανούς στόχους NiRAN στις πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από το HCoV-229E ORF1a, οι οποίες είναι γνωστό ότι βοηθούν άμεσα ή έμμεσα το ρεπλικάση του RTC που κωδικοποιείται από το ORF1b (12, 35).Τα πειράματά μας παρέχουν πειστικά στοιχεία για την αποτελεσματική και ειδική NMPylation του nsp9 (Εικόνα 2).Εάν η πρωτεΐνη στόχος χρησιμοποιείται σε μοριακή περίσσεια που είναι 8 έως 10 φορές υψηλότερη από αυτή του ενζύμου (nsp12), επιβεβαιώνεται ότι η nsp9 είναι πλήρως (μονο)NMPized (Εικόνα 4).Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ nsp12 και nsp9 είναι βραχύβια και δεν θα σχηματίσει ένα σταθερό σύμπλεγμα με το nsp9 (ελλείψει άλλων υπομονάδων RTC).Αυτό το συμπέρασμα υποστηρίζεται από μελέτες αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών για το πρωτεϊνό SARS-CoV (35).Η ανάλυση MS αναγνώρισε την πρωτοταγή αμίνη του Ν-τερματικού υπολείμματος του nsp9 ως τη θέση ΝΜΡυλίωσης (Παράρτημα SI, Εικόνα S5).Ο σχηματισμός του φωσφοραμιδικού δεσμού και της Ν-τερματικής αμινομάδας διακρίνει τη δραστικότητα ΝΜΡυλίωσης με τη μεσολάβηση NiRAN από την αντίδραση ΑΜΠυλίωσης με μεσολάβηση Pseudomonas syringae, η οποία καταλύει τον σχηματισμό Ο-συνδεδεμένης ΑΜΡ σε υπολείμματα Ser, Thr ή Tyr. 22), και το S. typhimurium YdiU σχηματίζει Ο-συνδεδεμένα (με Tyr) και Ν-συνδεδεμένα (με His) προϊόντα προσθήκης πεπτιδίου-UMP.Οι περιορισμένες διαθέσιμες πληροφορίες για την οικογένεια πρωτεϊνών SelO υποδεικνύουν ότι τα μέλη αυτής της μεγάλης οικογένειας πρωτεϊνών διαφέρουν πολύ στον σχηματισμό προϊόντων προσθήκης πεπτιδίου-ΝΜΡ.Αυτή είναι μια ενδιαφέρουσα παρατήρηση που αξίζει περαιτέρω μελέτης.
Τα δεδομένα που ελήφθησαν σε αυτή τη μελέτη μας οδήγησαν να υποθέσουμε ότι η ΝΜΡυλίωση του nsp9 απαιτεί ένα ελεύθερο Ν-άκρο.Στο πλαίσιο της ιικής αντιγραφής, αυτό θα παρέχεται από την πρωτεολυτική διάσπαση της θέσης επεξεργασίας nsp8|nsp9 στην πολυπρωτεΐνη ρεπλικάσης pp1a με τη μεσολάβηση των Mpro και pp1ab.Στους περισσότερους κοροναϊούς, η διαφορά μεταξύ αυτής της συγκεκριμένης τοποθεσίας (VKLQ|NNEI στο HCoV-229E) και όλων των άλλων θέσεων διάσπασης του κορωνοϊού Mpro είναι το Asn (και όχι ένα άλλο μικρό υπόλειμμα, όπως Ala, Ser ή Gly) που καταλαμβάνει το P1â;??Τοποθεσία (36).Τα δεδομένα διάσπασης πεπτιδίων που ελήφθησαν στις πρώιμες μελέτες έδειξαν ότι η αποτελεσματικότητα διάσπασης της θέσης nsp8|nsp9 ήταν χαμηλότερη από αυτή άλλων θέσεων, υποδεικνύοντας ότι 1) αυτή η συγκεκριμένη θέση μπορεί να έχει ρυθμιστικό ρόλο στην έγκαιρη συντονισμένη επεξεργασία του C-τερματικού περιοχή pp1a, ή 2) α Ο ρόλος του ειδικού διατηρημένου nsp9 Ν-άκρου στην αντιγραφή του ιού (37).Τα δεδομένα μας (Εικόνα 5Α) έδειξαν ότι η ανασυνδυασμένη μορφή του nsp9 που φέρει την πραγματική Ν-τερματική αλληλουχία NMP έγινε αποτελεσματικά από το nsp12.Η Ν-τελική πλευρική αλληλουχία αφαιρέθηκε με παράγοντα Xa (nsp9-His6, προσάρτημα SI, Πίνακας S1) ή διάσπαση που προκαλείται από Mpro (nsp7-11-His6· Εικόνα 5Α και προσάρτημα SI, Πίνακας S1).Είναι σημαντικό ότι ο μη κομμένος πρόδρομος που περιέχει nsp9 nsp7-11-His6 έδειξε αντοχή στη NMPylation του nsp12, κάτι που είναι σύμφωνο με τα δεδομένα μας, υποδεικνύοντας ότι το προϊόν προσθήκης nsp9-NMP σχηματίζεται μέσω της Ν-τερματικής πρωτοταγούς αμίνης (παράρτημα SI, Εικόνα S5) .Για να αποκτήσουμε μια βαθύτερη κατανόηση της εξειδίκευσης του υποστρώματος NiRAN, στη συνέχεια επικεντρωθήκαμε στα παρακείμενα Ν-τερματικά υπολείμματα του nsp9.Ελλείψει άλλων πρωτεϊνών, είναι δομικά εύκαμπτες, αποτρέποντας τον εντοπισμό τους στη μη επισημασμένη μορφή του nsp9 (26 28, 38), υποδεικνύοντας την περιορισμένη φυσική τους διαφοροποίηση. Αυτό οφείλεται στη σημαντική ειδική για την αλληλουχία (δεν σχετίζεται με τη δευτερεύουσα δομή) λειτουργία του nsp9 Ν-τερματικού θραύσματος.Οι αντικαταστάσεις Ala των διατηρημένων υπολειμμάτων σε αυτή την περιοχή (Εικόνες 5C και D και παράρτημα SI, Εικόνα S8) αποκαλύπτουν ότι το N3826 είναι απαραίτητο για την nsp9 NMPylation in vitro, ενώ οι αντικαταστάσεις N3825A και E3827A οδηγούν σε μείωση της NMPylation, ενώ οι υποκαταστάσεις M3829A και P38 .Προφανώς επηρεάζει την NMPylation nsp9.Αν και η υποκατάσταση του Ν-τερματικού Asn (N3825A, N3825S) έχει μόνο μέτρια επίδραση στην nsp9 ΝΜΡυλίωση και τον αναδιπλασιασμό του ιού σε κυτταροκαλλιέργεια (Εικόνα 5C και D), η διαγραφή μιας αλληλουχίας υπολείμματος Asn από το Ν-τερματικό διπεπτίδιο 3825-NN Αποδείχθηκε ότι είναι θανατηφόρο για τους ιούς, υποδεικνύοντας ότι απαιτείται ένα υπόλειμμα Asn πριν από ένα άλλο υπόλειμμα στο Ν-άκρο, κατά προτίμηση Asn, αν και φαίνεται ότι η υποκατάσταση παρόμοιων υπολειμμάτων μπορεί να είναι μερικώς ανεκτή (Εικόνα 5Β, Γ και Δ).Συμπεραίνουμε ότι το διπεπτίδιο 3825-NN, ειδικά το διατηρημένο και απαραίτητο υπόλειμμα N3826 εντός του εύρους του κορωνοϊού (παράρτημα SI, Εικόνα S6), διασφαλίζει τη σωστή δέσμευση και προσανατολισμό του Ν-τελικού άκρου nsp9 στην ενεργό θέση του NiRAN.
Η αντικατάσταση του Ala (E3827A) για το διατηρημένο Glu όλων των υποοικογενειών διατηρεί την nsp9 NMPylation in vitro αλλά είναι θανατηφόρα για τους ιούς σε κυτταροκαλλιέργεια (Εικόνα 5C και D), υποδεικνύοντας την πρόσθετη λειτουργία αυτού του υπολείμματος, για παράδειγμα, σε βασικές αλληλεπιδράσεις (NMPylated ή μη τροποποιημένο ) nsp9 Ν-άκρο και άλλοι παράγοντες που εμπλέκονται στην αντιγραφή του ιού.Οι μεταλλάξεις Nsp9 δεν επηρέασαν την πρωτεολυτική διαδικασία του nsp9 ή οποιουδήποτε παρακείμενου nsps (39) (Παράρτημα SI, Εικόνα S9), υποδεικνύοντας ότι οι θανατηφόροι φαινότυποι αρκετών μεταλλάξεων nsp9 που παρατηρήθηκαν δεν προκλήθηκαν από τη δυσρύθμιση της περιοχής C πρωτεολυτικής διεργασίας-τερματικό pp1a .
Τα παραπάνω δεδομένα παρέχουν ενδείξεις ότι μετά από θεραπεία με τη μεσολάβηση Mpro της θέσης διάσπασης nsp8|9 στο pp1a/pp1ab, το Ν-άκρο του nsp9 μπορεί να είναι UMPυλιωμένο (ή μερικώς τροποποιημένο με άλλο NMP).Επιπλέον, η εξαιρετική διατήρηση του Ν-άκρου του nsp9 (συμπεριλαμβανομένων των μοναδικών και αμετάβλητων υπολειμμάτων Asn στην οικογένεια των κοροναϊών) και τα δεδομένα αντίστροφης γενετικής που ελήφθησαν σε αυτή τη μελέτη (Εικόνες 3Ε και 5Δ) μας οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η περιγραφόμενη nsp9 NMPylation είναι βιολογικά σχετικό και απαραίτητο για την αναπαραγωγή του κορωνοϊού.Οι λειτουργικές συνέπειες αυτής της τροποποίησης απομένουν να μελετηθούν, για παράδειγμα, σχετικά με την προηγουμένως περιγραφείσα (μη ειδική) δραστηριότητα δέσμευσης RNA nsp9 (μη τροποποιημένη μορφή) (2628).Η Ν-τερματική NMPylation μπορεί επίσης να επηρεάσει την αλληλεπίδραση του nsp9 με υποστρώματα πρωτεΐνης ή RNA ή τον σχηματισμό διαφορετικών συγκροτημάτων τεσσάρων επιπέδων.Αυτά έχουν παρατηρηθεί σε δομικές μελέτες και έχουν επιβεβαιωθεί ότι σχετίζονται λειτουργικά με την αντιγραφή του κορωνοϊού, αν και ειδικά απουσία Στην περίπτωση αυτής της τροποποίησης (26- ââ29, 40).
Αν και η εξειδίκευση στόχου του τομέα NiRAN του κορωνοϊού πρέπει ακόμη να χαρακτηριστεί με περισσότερες λεπτομέρειες, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η εξειδίκευση στόχου πρωτεΐνης του τομέα NiRAN του κορωνοϊού είναι πολύ περιορισμένη.Αν και η διατήρηση των βασικών υπολειμμάτων ενεργών θέσεων (8, 16) στον τομέα NiRAN όλων των οικογενειών nidovirus υποστηρίζει ισχυρά τη δραστηριότητα του συντηρημένου NMPylator αυτών των πρωτεϊνών, η ταυτότητα των υπολειμμάτων θύλακα που δεσμεύει το υπόστρωμα αυτού του τομέα Διατήρηση και διατήρηση παραμένει να χαρακτηριστεί , και μπορεί να διαφέρει μεταξύ διαφορετικών οικογενειών για σκοπούς Nidovirales.Ομοίως, οι σχετικοί στόχοι άλλων ένθετων ιών δεν έχουν ακόμη καθοριστεί.Μπορεί να είναι απομακρυσμένα ορθόλογα του nsp9 ή άλλων πρωτεϊνών, επειδή οι αλληλουχίες εκτός των πέντε περιοχών ρεπλικάσης που γενικά διατηρούνται σε ένθετους ιούς είναι λιγότερο διατηρημένες (8), συμπεριλαμβανομένης της συστοιχίας γονιδιώματος μεταξύ Mpro και NiRAN. Μεταξύ αυτών, η nsp9 βρίσκεται στο κορωνοϊός.
Επιπλέον, δεν μπορούμε προς το παρόν να αποκλείσουμε το ενδεχόμενο ο τομέας NiRAN να έχει επιπλέον στόχους (συμπεριλαμβανομένων των κινητών).Σε αυτήν την περίπτωση, αξίζει να αναφέρουμε ότι τα βακτηριακά ομόλογα σε αυτούς τους αναδυόμενους πρωτεϊνικούς NMPylators (NMPylators) (30, 31) φαίνεται να έχουν «κύριους ρυθμιστές»;Το NMP ρυθμίζει μια ποικιλία κυτταρικών πρωτεϊνών για να ρυθμίσει ή να εξαλείψει τις κατάντη δραστηριότητές τους, παίζοντας έτσι ένα ρόλο σε μια ποικιλία βιολογικών διεργασιών, όπως η απόκριση του κυτταρικού στρες και η ομοιόσταση οξειδοαναγωγής (22, 33).
Σε αυτή τη μελέτη (Εικόνες 2 και 4 και Παράρτημα SI, Σχήματα S3 και S5), μπορέσαμε να αποδείξουμε ότι η nsp12 μετέφερε το τμήμα UMP (NMP) σε μια ενιαία (συντηρημένη) θέση στο nsp9, ενώ άλλες πρωτεΐνες δεν τροποποιήθηκαν στο χρησιμοποιείται Υπό τις συνθήκες, υποστηρίζεται καλά καθορισμένη (και όχι χαλαρή) ειδικότητα υποστρώματος.Σε συμφωνία με αυτό, σε σύγκριση με την Ν-τερματική nsp9 NMPylation, η δραστηριότητα NMPylation της ίδιας της nsp12 είναι πολύ χαμηλή, η ανίχνευσή της απαιτεί μεγαλύτερο χρόνο έκθεσης σε αυτοραδιογραφία και χρησιμοποιείται 10πλάσια αύξηση στη συγκέντρωση nsp12.Επιπλέον, η ανάλυσή μας MS απέτυχε να παράσχει στοιχεία για ΝΜΡυλίωση του nsp12, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αυτο-ΝΜΡυλίωση του τομέα NiRAN είναι (στην καλύτερη περίπτωση) δευτερεύουσα δραστηριότητα.Ωστόσο, θα πρέπει να σημειωθεί ότι άλλες μελέτες έχουν παράσχει προκαταρκτικά στοιχεία ότι η κατάσταση αυτο-ΑΜΠυλίωσης του βακτηριακού NMPylator μπορεί να ελέγχει τη δραστηριότητα NMPylation τους σε άλλα υποστρώματα πρωτεΐνης (22, 33).Ως εκ τούτου, απαιτείται περισσότερη έρευνα για τη διερεύνηση των πιθανών λειτουργικών επιδράσεων των δραστηριοτήτων αυτο-ΝΜΡυλίωσης που αναφέρθηκαν για το EAV nsp9 (16) και τον κοροναϊό nsp12 (αυτή τη μελέτη), συμπεριλαμβανομένης της προτεινόμενης επίδρασης παρόμοιου με συνοδηγό στην αναδίπλωση του C-τερματικού τομέα RdRp ( 16) ).
Προηγουμένως, έχουν εξεταστεί αρκετές υποθέσεις σχετικά με τις πιθανές κατάντη λειτουργίες της περιοχής Niran του νινδοϊού, συμπεριλαμβανομένης της λιγάσης RNA, της κουβανυλικής τρανσφεράσης που καλύπτεται με RNA και της ενεργότητας εκκίνησης πρωτεΐνης (16), αλλά καμία από αυτές δεν είναι συμβατή με τις διαθέσιμες κατάντη λειτουργίες.Οι πληροφορίες που λαμβάνονται στις ακόλουθες θέσεις είναι ακριβώς την ίδια στιγμή χωρίς να γίνονται πρόσθετες υποθέσεις.Τα δεδομένα που ελήφθησαν σε αυτή τη μελέτη είναι περισσότερο συνεπή (αλλά δεν μπορούν να αποδείξουν) ότι η περιοχή NiRAN εμπλέκεται στην έναρξη της επαγόμενης από πρωτεΐνες σύνθεσης RNA.Παλαιότερα πίστευαν ότι η λειτουργία του τομέα NiRAN σε 5??Η κάλυψη ²-RNA ή οι αντιδράσεις απολίνωσης RNA δεν επηρεάζονται από αυτά και η υποστήριξη άλλων δεδομένων.Επομένως, για παράδειγμα, η ενεργή θέση του NiRAN θεωρείται ότι περιλαμβάνει το διατηρημένο Asp ως γενική βάση (D252 στο Pseudomonas syringae SelO; D4271 στο HCoV-229E pp1ab; D208 στο SARS-CoV-2 nsp12) (Παράρτημα SI, εικόνα 2 ).S2) (17, 22, 33), ενώ η κατάλυση στην εξαρτώμενη από ATP λιγάση RNA και το ένζυμο κάλυψης RNA πραγματοποιείται από το ενδιάμεσο ομοιοπολικό ένζυμο-(λυσυλ-Ν)-ΝΜΡ, το οποίο περιλαμβάνει ένα μη αλλαγμένο υπόλειμμα Lys ( 41).Επιπλέον, η αξιοσημείωτη εξειδίκευση του κορωνοϊού NiRAN βάσει αλληλουχίας για διατηρημένους πρωτεϊνικούς στόχους και η χαλαρή εξειδίκευση για συν-υποστρώματα NTP (προτιμά το UTP) αντιτίθεται στις λειτουργίες του ενζύμου κάλυψης με τη μεσολάβηση NiRAN ή των λειτουργιών που μοιάζουν με λιγάση RNA.
Προφανώς, απαιτείται πολλή επιπλέον δουλειά για την επαλήθευση και, εάν αποδειχθεί, την επεξεργασία του πιθανού ρόλου του nsp9-UMP (nsp9-NMP) στην επαγόμενη από πρωτεΐνες σύνθεση RNA, η οποία θα συνδέσει πολλές ενδιαφέρουσες αλλά (μέχρι στιγμής) αναφορές που έχουν αναφερθεί προηγουμένως .Μεμονωμένες παρατηρήσεις.Για παράδειγμα, έχει προσδιοριστεί ότι το άκρο του αρνητικού κλώνου RNA του κορωνοϊού ξεκινά με έναν κλώνο ολιγο(U) (42, 43).Αυτή η παρατήρηση είναι σύμφωνη με την ιδέα ότι η σύνθεση του αρνητικού κλώνου RNA ξεκινά με τη δέσμευση της UMPυλιωμένης μορφής του nsp9 στην ουρά πολυ(Α) (ενεργοποιητές), η οποία μπορεί να προάγεται από τη δέσμευσή του RNA. Η δραστηριότητα και/ή η αλληλεπίδραση με άλλη πρωτεΐνη RTC.Το τμήμα UMP που παρέχεται από το nsp9 μπορεί στη συνέχεια να χρησιμοποιηθεί ως «ένας εκκινητής» για ολιγουριδυλίωση που προκαλείται από nsp7/8/nsp12, χρησιμοποιώντας την ουρά 3;?²-πολυ(Α) στο γονιδιωματικό RNA ή άλλη αλληλουχία που περιέχει ολιγονουκλεοτίδιο (Α) χρησιμεύει ως πρότυπο, παρόμοιο με τον μηχανισμό που καθιερώθηκε για την πρωτεΐνη VPg του picornavirus (44).Τι γίνεται αν η πρόταση είναι «μη κανονιστική»;???Η έναρξη της (προκαλούμενης από πρωτεΐνη) σύνθεσης αρνητικού κλώνου RNA παρέχει μια σύνδεση με τις παρατηρήσεις, υποδεικνύοντας ότι το RNA αρνητικού κλώνου κορωνοϊού έχει UMP (αντί για UTP) στο άκρο του (42), το οποίο θεωρείται ότι υποδεικνύει ότι Το νουκλεϊκό οξύ Dicer διασπά το άκρο φωσφορυλιωμένο από μια άγνωστη ειδική για την ουριδίνη ενδονουκλεάση.Εάν επιβεβαιωθεί, αυτή η υδρολυτική δραστηριότητα νουκλεϊκού οξέος μπορεί να βοηθήσει στην απελευθέρωση της ολιγομερικής UMPυλιωμένης μορφής του nsp9 από το άκρο 5 ² του εκκολαπτόμενου αρνητικού κλώνου.Ο πιθανός ρόλος του nsp9 στην εκκίνηση πρωτεϊνών είναι επίσης συνεπής με προηγούμενες μελέτες αντίστροφης γενετικής, οι οποίες έδειξαν ότι το nsp9 (και το nsp8) αλληλεπιδρούν κριτικά και συγκεκριμένα με το διατηρημένο στοιχείο RNA που ενεργεί cis κοντά στο 3 άκρο του γονιδιώματος του κοροναϊού.45).Σύμφωνα με αυτήν την έκθεση, αυτές οι προηγούμενες παρατηρήσεις μπορούν τώρα να επανεξεταστούν και να επεκταθούν μέσω περαιτέρω έρευνας.
Συνοπτικά, τα δεδομένα μας προσδιόρισαν την ειδική δραστηριότητα μιας ιδιόκτητης ετικέτας ενζύμου ένθετου ιού που συνδέεται με RdRp στο Ν-άκρο.Στον κοροναϊό, αυτή η δραστηριότητα UMPylator/NMPylator με τη μεσολάβηση NiRAN που ανακαλύφθηκε πρόσφατα χρησιμοποιείται για να βασίζεται σε υπολείμματα Mn2+ και παρακείμενα Asn και να προκαλέσει το σχηματισμό δεσμών φωσφοραμιδικού (χαμηλής ενέργειας) με τη Ν-τερματική πρωτοταγή αμίνη.Μέσω της διάσπασης που προκαλείται από Mpro στη θέση διάσπασης nsp8|9, ο στόχος nsp9 μπορεί να χρησιμοποιηθεί για NMPylation, υποδεικνύοντας τη λειτουργική σύζευξη μεταξύ της πρωτεάσης και της περιοχής NiRAN, η οποία εκτείνεται έως το RdRp.Η διατήρηση των βασικών υπολειμμάτων στην ενεργή θέση nsp12 NiRAN και τον στόχο nsp9, σε συνδυασμό με δεδομένα που ελήφθησαν από δύο κοροναϊούς συμπεριλαμβανομένου του SARS-CoV-2, παρέχει ισχυρές ενδείξεις ότι η nsp9 NMPylation είναι κορωνοϊός Τα συντηρητικά χαρακτηριστικά αποτελούν επίσης βασικό βήμα στην αναπαραγωγή του ιού.Τα διαθέσιμα δεδομένα μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι ο ειδικός ρόλος της ΝΜΡυλιωμένης μορφής του nsp9 στη σύνθεση RNA που προκαλείται από πρωτεΐνες είναι ένα λογικό σενάριο για τον κοροναϊό και άλλους ένθετους ιούς και το NiRAN μπορεί επίσης να στοχεύει άλλες μη αναγνωρισμένες πρωτεΐνες.Ρυθμίστε τον ιό.Αλληλεπίδραση οικοδεσπότη.Εάν επιβεβαιωθεί, η συμμετοχή πρωτεϊνικών εκκινητών στη σύνθεση ιικού RNA θα αυξήσει τη συγγένεια αλληλουχίας των περιοχών Mpro/3CLpro και RdRp μεταξύ της προηγουμένως ανιχνευθείσας υπερομάδας κοροναϊού και τύπου picornavirus (9), που έχουν πλέον ενοποιηθεί στους πρόσφατα καθιερωμένους Pisonivirites ( 46) στην κατηγορία.
Τα δεδομένα μας δείχνουν επίσης ότι οι βασικές, επιλεκτικές και συντηρητικές ενζυμικές δραστηριότητες που προσδιορίζονται σε αυτή τη μελέτη μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως στόχοι για αντιιικά φάρμακα.Οι ενώσεις που παρεμβαίνουν στη δέσμευση (και στην επακόλουθη τροποποίηση) του διατηρημένου nsp9 Ν-τελικού άκρου στη δραστική θέση του NiRAN μπορούν να αναπτυχθούν σε αποτελεσματικά και ευέλικτα αντιιικά φάρμακα, κατάλληλα για τη θεραπεία κορωνοϊών ζώων και ανθρώπων από λοιμώξεις διαφορετικού (υπο)γένους , συμπεριλαμβανομένου του SARS-CoV-2 και του κορωνοϊού του αναπνευστικού συνδρόμου της Μέσης Ανατολής.
Η κωδικεύουσα αλληλουχία της πρωτεΐνης του κοροναϊού που παρήχθη σε αυτή τη μελέτη ενισχύθηκε με RT-PCR χρησιμοποιώντας RNA που απομονώθηκε από Huh-7 μολυσμένο με HCoV-229E ή Vero E6 μολυσμένο με SARS-CoV-2 και εισήχθη χρησιμοποιώντας τυπικές διαδικασίες κλωνοποίησης.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) ή φορέας έκφρασης pASK3-Ub-CHis6 (47) (Παράρτημα SI, Πίνακες S1 και S2).Οι υποκαταστάσεις απλού κωδικονίου εισήχθησαν με μεταλλαξογένεση κατευθυνόμενης σε θέση που βασίζεται σε PCR (48).Για να παραχθεί η πρωτεΐνη σύντηξης ΜΒΡ, τα κύτταρα ΤΒ1 Ε. coli μετασχηματίστηκαν με το κατάλληλο κατασκεύασμα πλασμιδίου pMAL-c2 (προσάρτημα SI, Πίνακας S1).Η πρωτεΐνη σύντηξης καθαρίστηκε με χρωματογραφία συγγένειας αμυλόζης και διασπάστηκε με παράγοντα Χα.Στη συνέχεια, η καρβοξυτελική πρωτεΐνη His6 καθαρίστηκε με χρωματογραφία συγγένειας μετάλλου ακινητοποιημένου Ni (Ni-IMAC) όπως περιγράφηκε προηγουμένως (49).Για την παραγωγή της πρωτεΐνης σύντηξης ουβικιτίνης, τα κύτταρα Ε. coli TB1 χρησιμοποίησαν το κατάλληλο κατασκεύασμα πλασμιδίου pASK3-Ub-CHis6 (Παράρτημα SI, Πίνακες S1 και S2) και το πλασμίδιο pCGI DNA που κωδικοποιεί την ειδική για την ουβικιτίνη C-τερματική υδρολάση 1 (Ubp1).Μεταμόρφωση (47).Η C-τερματική πρωτεΐνη κορωνοϊού με επισήμανση His6 καθαρίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (50).
Η δοκιμή αυτο-ΝΜΡυλίωσης του HCoV-229E nsp12-His6 πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο EAV nsp9 (16).Εν ολίγοις, το nsp12-His6 (0,5 μΜ) περιέχει 50 mM 4-(2-υδροξυαιθυλ)-1-πιπεραζινοαιθανοσουλφονικό οξύ (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM διθειοθρεϊτόλη (DTT), 6 mM MnCl2, 25 μΜ ρυθμιστικό διάλυμα το καθορισμένο ΝΤΡ και 0,17 μΜ ταιριάζουν με [α32-Ρ]ΝΤΡ (3.000 Ci/mmol, Hartmann Analytic) στους 30 °C για 30 λεπτά.Σε όλες τις άλλες (τυποποιημένες) δοκιμασίες ΝΜΡυλίωσης της nsp9 NMPylation με τη μεσολάβηση nsp12, οι συνθήκες αντίδρασης ρυθμίζονται ως εξής: nsp12-His6 (0,05 μΜ) και nsp9-His6 (4 μΜ) παρουσία 50 mM HEPES-KOH (ρΗ 8,0 ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 μΜ υποδεικνύεται ΝΤΡ, και 0,17 μΜ ταιριαστό [α32-Ρ]ΝΤΡ.Μετά από επώαση για 10 λεπτά στους 30°C, το δείγμα αντίδρασης αναμίχθηκε με ρυθμιστικό δείγματος SDS-PAGE: 62,5 mM τρις(υδροξυμεθυλ)αμινομεθάνιο HCl (ρΗ 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% γλυκερόλη και 0,0005% βρωμοφαινόλη μπλε.Η πρωτεΐνη μετουσιώθηκε με θέρμανση στους 90°C για 5 λεπτά και διαχωρίστηκε με 12% SDS-PAGE.Το πήκτωμα στερεώνεται και χρωματίζεται με διάλυμα Coomassie Brilliant Blue (40% μεθανόλη, 10% οξικό οξύ, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), αποχρωματίζεται και εκτίθεται σε οθόνη φωσφορίζουσας απεικόνισης για 20 ώρες (για ανίχνευση nsp12 από NMPylation) ή (μέγιστο) 2 ώρες (για αξιολόγηση nsp9 NMPylation).Χρησιμοποιήθηκε συσκευή απεικόνισης Typhoon 9200 (GE Healthcare) για τη σάρωση της οθόνης και το ImageJ χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της έντασης του σήματος.
Για ανάλυση MS, χρησιμοποιήθηκαν 1 μΜ nsp12-His6 και 10 μΜ nsp9 (χωρίς ετικέτα εξαιστιδίνης) στην ανάλυση ΝΜΡυλίωσης (παράρτημα SI, Πίνακας S1) και χρησιμοποιήθηκαν η αυξημένη συγκέντρωση 500 μΜ UTP και GTP.Ανάλογα με τη συγκέντρωσή τους και την αναμενόμενη ποιότητα πρωτεΐνης, χρησιμοποιήθηκε ένα σύστημα HPLC Waters ACQUITY H-Class εξοπλισμένο με στήλη MassPrep (Waters) για την αφαλάτωση 1 έως 10 μL ρυθμιστικών πρωτεϊνικών διαλυμάτων online.Η αφαλατωμένη πρωτεΐνη εκλούεται στην πηγή ιόντων ηλεκτροψεκασμού του φασματόμετρου μάζας Synapt G2Si (Waters) μέσω της ακόλουθης βαθμίδας ρυθμιστικού διαλύματος Α (νερό/0,05% μυρμηκικό οξύ) και ρυθμιστικού διαλύματος Β (ακετονιτρίλιο/0,045% μυρμηκικό οξύ) και η θερμοκρασία της στήλης είναι 60 ° C και ταχύτητα ροής 0,1 mL/min: έκλουση ισοκρατικά με 5% A για 2 λεπτά, στη συνέχεια γραμμική κλίση στο 95% B εντός 8 λεπτών και διατήρηση 95% B για άλλα 4 λεπτά.
Ανιχνεύονται θετικά ιόντα με εύρος μάζας από 500 έως 5000 m/z.Το Glu-fibrinopeptide B μετράται κάθε 45 δευτερόλεπτα για αυτόματη διόρθωση της μετατόπισης μάζας.Χρησιμοποιήστε το λογισμικό οργάνων MassLynx με επέκταση MaxEnt1 για να αποσυνδεθεί το μέσο φάσμα μετά την αφαίρεση της γραμμής βάσης και την εξομάλυνση.
Το UMPylated HCoV-229E nsp9 υποβλήθηκε σε πέψη με την προσθήκη τροποποιημένης θρυψίνης βαθμού αλληλουχίας (Serva) και επωάστηκε όλη τη νύχτα στους 37 °C.Μια στήλη περιστροφής Chromabond C18WP (αριθμός εξαρτήματος 730522, Macherey-Nagel) χρησιμοποιήθηκε για την αφαλάτωση και τη συμπύκνωση των πεπτιδίων.Τέλος, το πεπτίδιο διαλύθηκε σε 25 μL νερού, το οποίο περιείχε 5% ακετονιτρίλιο και 0,1% μυρμηκικό οξύ.
Τα δείγματα αναλύθηκαν με MS χρησιμοποιώντας φασματόμετρο μάζας Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Το απόλυτο σύστημα nanoâ HPLC (Dionex), εξοπλισμένο με προσαρμοσμένη στο τέλος 50 cm;Στήλη 75 μm C18 RP γεμάτη με μαγνητικά σφαιρίδια 2,4 μm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Συνδεθείτε στο φασματόμετρο μάζας ηλεκτρονικά μέσω της πηγής νανοψεκασμού Proxeon.εγχύστε 6 μL διαλύματος πέψης θρυψίνης σε 300 μm εσωτερικής διαμέτρου ×??Στήλη προσυγκέντρωσης C18 PepMap 1 cm (Thermo Scientific).Χρησιμοποιώντας νερό/0,05% μυρμηκικό οξύ ως διαλύτη, το δείγμα παγιδεύτηκε αυτόματα και αφαλατώθηκε με ρυθμό ροής 6 μL/min.
Οι ακόλουθες διαβαθμίσεις νερού/0,05% μυρμηκικό οξύ (διαλύτης Α) και 80% ακετονιτρίλιο/0,045% μυρμηκικό οξύ (διαλύτης Β) χρησιμοποιήθηκαν για να επιτευχθεί ο διαχωρισμός τρυπτικών πεπτιδίων με ρυθμό ροής 300 nL/min: 4% Β για 5 λεπτά, μετά 30 A γραμμική κλίση σε 45% Β μέσα σε λίγα λεπτά και γραμμική αύξηση στο 95% διαλύτη Β μέσα σε 5 λεπτά.Συνδέστε τη χρωματογραφική στήλη σε νανοεκπομπό από ανοξείδωτο χάλυβα (Proxeon) και ψεκάστε το υγρό έκλουσης απευθείας στο θερμαινόμενο τριχοειδές του φασματόμετρου μάζας χρησιμοποιώντας δυναμικό 2.300 V. Η σάρωση έρευνας με ανάλυση 60.000 στον αναλυτή μάζας Orbitrap σχετίζεται με τουλάχιστον τρεις σαρώσεις δεδομένων MS/MS, δυναμικά αποκλεισμένες για 30 δευτερόλεπτα, με χρήση γραμμικής διάστασης επαγόμενης από σύγκρουση παγίδας ιόντων ή διάστασης σύγκρουσης υψηλότερης ενέργειας σε συνδυασμό με ανίχνευση τροχιάς, Η ανάλυση είναι 7.500.
Ώρα δημοσίευσης: Αυγ-03-2021